肿瘤微生物（Tumor Microbiome）是指肿瘤环境中所有的微生物，有助于微环境重塑，与肿瘤的发生发展紧密相关。肿瘤微生物可以通过增加突变直接促进肿瘤发生，或者调节致癌基因或致癌通路，以及通过调节宿主免疫系统减少或增强肿瘤进展。最近的研究挑战性地声称，细菌、病毒和（或）真菌在癌症中普遍存在，它们是癌症免疫治疗的关键因素，可以通过工程手段治疗转移。

肿瘤微生物组是肿瘤微环境中不可或缺的成员，肿瘤内微生物群通过多种机制影响肿瘤发展，在不同类型的肿瘤中，肿瘤内微生物群的组成和丰度具有高度异质性。但由于肿瘤微生物生物量很低，肿瘤样本呈现出很高的宿主与细菌DNA比率，导致基于扩增子策略的16S rRNA基因测序，受宿主DNA干扰，引起菌群序列PCR扩增效率降低，甚至扩增失败。基于以上情况，对于肿瘤样本微生物的检测采用5R 16S测序。

5R 16S rDNA高通量测序，是对16S rDNA基因上的五个区域（V2、V3、V5、V6、V8）进行多重PCR扩增和测序。可有效降低组织中宿主DNA对细菌16S rDNA扩增的严重干扰。与常规扩增子1-2个V区（例如V3-V4、V4）扩增策略相比，此方法扩增出的区域覆盖约68%的16S全长序列，可以大幅提高细菌物种检测的覆盖率和分辨率，尤其适合于低生物量的微生物样本检测。不仅如此，5R 16S测序还能兼容有一定程度降解的FFPE样本。

（1）样本重复数推荐15个以上；

（2）需要设置空白对照。可有效去除来自样本采集、DNA 提取、PCR 扩增等环节中引入的污染菌；

（3）取样建议：例如刮擦ddH₂O的棉签；肿瘤组织可以用实验室内部的ddH₂O作为阴性对照；棉签擦拭工作台等一切实验端污染来源。

案例一

中文标题：人类肿瘤微生物组由肿瘤类型特异性细胞内细菌组成

发表期刊：Science（IF:47.728）

发表时间：2020

样本类型：冻存组织和FFPE样本

本研究对1526个肿瘤及其相邻的正常组织（包括乳腺、肺、卵巢、胰腺、黑色素瘤、骨瘤和脑瘤）进行5R 16S rDNA测序，发现每种肿瘤类型都有独特的微生物组组成，其中乳腺癌的微生物组尤其丰富多样。肿瘤内的细菌大多为胞内细菌，存在于癌细胞和免疫细胞中。研究还注意到，肿瘤内的细菌或其预测的功能与肿瘤类型和亚型、患者吸烟状况以及对免疫疗法的反应存在关联。

案例二

中文标题：静脉给药活体单核增生李斯特菌以引起肿瘤焦亡和抗肿瘤免疫响应

发表期刊：Angwandte Chemie International Edition（IF:18.027）

发表时间：2022

样本类型：肿瘤组织

本研究通过对小鼠静脉注射PBS、Lmo（单核细胞增生李斯特菌）以及Lmo@RBC（改造后的单核细胞增生李斯特菌）来比较肿瘤免疫治疗效果。通过5R 16S测序对肿瘤组织内的菌群进行检测，结果发现李斯特菌仅出现在Lmo和Lmo@RBC组中。进一步实验发现，Lmo@RBC可诱导细胞焦亡，从而逆转免疫抑制性肿瘤微环境并促进全身性的抗肿瘤免疫反应，对实体瘤和肿瘤转移有极好的治疗效果。

参考文献

[1]The human tumor microbiome is composed of tumor type-specific intracellular bacteria. Science. 2020;368(6494):973-980.

[2]Intravenous Delivery of Living Listeria monocytogenes Elicits Gasdmermin-Dependent Tumor Pyroptosis and Motivates Anti-Tumor Immune Response. ACS Nano. 2022;16(3):4102-4115.