微生物对整个生态系统的功能、稳定性和可持续性至关重要，然而，常规扩增子测序只能反映样本间每种微生物的相对含量，却不能体现样本中物种的真实数量和组间样本的真实差异，也忽视了不同细菌/真菌的16S/ITS拷贝数差异，可能导致对微生物生态功能的误判。例如有两个群落，一个随着时间的推移逐渐繁盛，另一个逐渐消亡，但相对定量显示为相同的结论。相对丰度数据的组成性质因此可能掩盖群落动态，无法真实还原群落的繁盛和消亡。绝对定量能够更真实还原微生物的群落动态变化。
图1 绝对定量能够更真实还原微生物的群落动态变化[1]
为了克服常规16S/ITS基因高通量测序研究的局限性，2016年，Frank Stämmler等人提出建议将外源细菌spike-in制备成标准品，以量化绝对细菌丰度的比例，并命名为spike-in-based calibration to total microbial load (SCML)[2]。研究者使用含有确定数量的spike-in细菌Salinibacter ruber，Rhizobium Radiobter和Alcylobacillusacdiphus，通过这些spike-in细菌的16S rDNA reads计数来调整内源性细菌的read计数，以分析总微生物载量的变化，结果表明肠道微生物组研究中的外源性spike-in细菌标准品可以估计绝对OTU丰度的比例，为肠道微生物组的结构和动力学提供新的见解。该方法可解析样本中总细菌和特定菌种的绝对拷贝数，揭示微生物绝对丰度信息，为研究者提供更为准确微生物群落结构及其动态变化信息。同时也能得到环境样本中的物种组成信息。
图2 Spike-in分析原理图[2]
凌恩生物推出微生物多样性绝对定量（spike-in），通过在样品中添加人工合成的已知拷贝数的spike-in 内标序列，之后进行16S/ITS扩增子文库构建、测序。通过比较测序得到的内标序列的reads数与其已知的拷贝数，建立标准计算公式，从而计算样品中各微生物的绝对拷贝数。
图3 凌恩生物Spike-in绝对定量原理示意图
二代实验流程：
三代实验流程：
| 内容 | 项目 | 引物名称 | 序列 | 扩增产物长度 |
| 二代 | 16S rRNA | 341F | 5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’ | 450bp |
| 806R | 5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’ |
| ITS | ITS1F | 5’- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’ | 300bp |
| ITS2R | 5’- GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’ |
| 三代全长 | 16S全长 | 27F | 5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′ | 1.5K |
| 1492R | 5′-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′ |
| ITS全长 | ITS1 | 5′- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′ | 0.6-0.7K |
| ITS4 | 5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ |
Ø 一次测序三套数据，极致性价比的科研之选 相对定量结果、绝对定量结果、两者联合分析结果； |
Ø 数据量更大 推荐常规数据量10-20w tags，去除Spike-in DNA后，有效数据可达10w+条，注释结果更准确； |
Ø 分析内容更全面 可选择OTU聚类和ASV序列降噪分析方法，涵盖30+项主流分析内容； |
Ø 多平台支持 凌恩生物可根据老师需求，选择不同的测序平台，二代、三代、进口、国产等。 |
| 样本类型 | 取样量 |
土壤
| ≥5g |
| 粪便 | ≥2g |
| DNA | （1）DNA总量≥1ug （2） 浓度≥20ng/ul |
| 文章标题 | 杂志名 | 影响因子 | 发表时间 | 合作单位 |
| Production of Helvolic Acid in Metarhizium Contributes to Fungal Infection of Insects by Bacteriostatic Inhibition of the Host Cuticular Microbiomes | Microbiology | 9.043 | 2022 | 中科院上海 植物生理生态研究所 |
| Microbiome assembly on Drosophila body surfaces benefits the flies to combat fungal infections | iScience | 7.396 | 2022 | 中科院上海 植物生理生态研究所 |
| Integrating experiments with modeling to understand key bacterial taxa dynamics after episodic mixing of a stratified water column | J Environ Manage | 8 | 2024 | 河海大学 |
| Effects of dietary energy levels on microorganisms andshort-chain fatty acids of rumen and tight junction p roteinsin Honghe Yellow cattle | Frontiers in Microbiology | 5.2 | 2024 | 云南农业大学 |
| Pseudomonas chlororaphis IRHB3 assemblies beneficialmicrobes and activates JA-mediated resistance to promotenutrient utilization and inhibit pathogen attack | Frontiers in Microbiology | 5.2 | 2024 | 四川农业大学 |
| Soil intake modifies the gut microbiota and alleviates Th2.type immune response in an ovalbumin-induced asthmamouse model | World Allergy Organization Journal | 5.1 | 2024 | 东南大学 |
| Age-Dependent Increase ofBacterial Loads on Drosophila Surface Benefits the Flies to Combat Fungal Infections | Social Science Research Network | 3.2 | 2021 | 中科院上海 植物生理生态研究所 |
参考文献
[1] Multi-kingdom ecological drivers of microbiota assembly in preterm infants.Nature,2021.
[2] Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome, 2016.
