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背景介绍

土壤真菌具有重要的生态功能,是生态系统中的重要组成部分,既包含有益真菌,也包含病原真菌,它们共同构成了土壤真菌的多样性。土壤真菌的多样性及其群落结构组成是评价其所在生态系统健康稳定的重要指标之一。近年来不仅对土壤真菌多样性和群落结构特征方面进行研究,而且对其生物功能,如土壤 真菌在生物防治、有害物质吸附和降解等方面也进行了研究和探索

土壤微生物蕴藏着丰富的生物资源,土壤真菌是土壤微生物的主要成员,并与其他微生物一起推动着陆地生态系统的能源流动和物质循环,维持着生态系统正常运转,是生态系统中最重要的组成部分。土壤真菌多样性及其群落结构组成都对生态系统产生深远的影响,对农作物生产,生态系统的平衡起着重要的作用,根际土壤真菌作为根际生态系统中的重要组成,是分解者中的先锋物种,在维持根际生态系统稳定、代谢调节和抗病虫害等方面有重要调节作用土壤真菌数量巨大,种类繁多。传统的培养法遗漏了土壤中绝大多数真菌,难以反映真菌群落多样性全貌。分子指纹图谱如变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresisDGGE)和末端限制性片段长度多态性(terminal-restriction fragment length polymorphismT-RFLP)方法虽然具有高通量的优势,能够指示不同群落结构的差别,但对微生物的认识也是有限的。克隆测序的方法虽然能给出微生物群落的更多信息,但与土壤真菌巨大的多样性相比,克隆文库显得太小,提供的信息仍然偏少。高通量测序技术拥有数据产出通量高、获得信息丰富、快捷和读长长等优点,使人们有能力研究高度复杂的真菌群落和稀有的微生物类群,因此高通量测序技术越来越多地被应用于土壤微生物生态学研究中。

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项目介绍

微生物多样性测序,又名扩增子测序,是对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行测序,主要包括16S rDNA测序、18S rDNA测序、ITS测序及目标区域扩增子测序等。采用第二代高通量测序平台测定的16S/18S/ITS某个高变区域的序列,来反映环境样品在细菌、真菌、古菌分类方面物种之间的差异,对研究海洋、土壤、肠道粪便等环境中的微生物构成有重要的指导作用。

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凌恩生物根据不同的研究目的和需求,扩增子测序可以细分为如下4个产品:

16S rDNA测序:16S rDNA为编码原核生物核糖体小亚基rRNADNA序列,主要进行细菌或古菌的多样性分析。细菌核糖体RNArRNA有三种类型:5S rRNA120bp16S rRNA(约1540bp)和23S rRNA(约2900bp)。5S rRNA基因序列较短,包含的遗传信息较少,不适于细菌种类的分析鉴定;23S rRNA基因的序列太长,且其碱基的突变率较高,不适于鉴定亲缘关系较远的细菌种类;16S rRNA普遍存在于原核细胞中,且含量较高、拷贝数较多(占细菌RNA总量的80%以上),便于获取模板,功能同源性高,遗传信息量适中,适于作为细菌多样性分析的标准。16S rRNA编码基因序列共有10个保守区和9个高可变区。

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18S rDNA测序:18S rDNA为编码真核生物核糖体小亚基rRNADNA序列,反映样品中真核生物之间的种类差异。与细菌多样性分析类似,在真核微生物中也有三类核糖体RNArRNA,包括5.8S rRNA18S rRNA28S rRNA18S rRNA基因是编码真核生物核糖体小亚基的DNA序列,其中既有保守区,也有可变区(V1-V9,没有V6区)。保守区域反映了生物物种间的亲缘关系,而可变区则能体现物种间的差异,适用于作种级及以上的分类标准。

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ITS测序:该类测序主要对环境微生物中的真菌多样性进行分析。包含两个区域:ITS1位于真核生物核糖体rDNA序列18S5.8S之间;ITS2位于真核生物核糖体rDNA序列5.8S28S之间。 ITS序列是内源转录间隔区(Internally Transcribed Spacer),位于真菌18S5.8S28S rRNA基因之间,分别为ITS 1ITS 2。在真菌中,5.8S18S28S rRNA基因具有较高的保守性,而ITS由于承受较小的自然选择压力,在进化过程中能够容忍更多的变异,在绝大多数真核生物中表现出极为广泛的序列多态性。同时,ITS的保守型表现为种内相对一致,种间差异较明显,能够反映出种属间,甚至菌株间的差异。并且ITS序列片段较小(ITS 1ITS 2长度分别为350 bp400 bp),易于分析,目前已被广泛用于真菌不同种属的系统发育分析。

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功能基因扩增子测序:根据客户的研究需求,基于功能基因/持家基因/靶基因等,对特定基因的PCR产物进行测序。在自然界的各类环境中,都有微生物的存在,它们在各自的“岗位”上都发挥着或大或小、或多或少的作用。有一些具有特殊功能的微生物,由于其作用的重要性或特殊性而受到人们的广泛关注,这些具有特殊功能的微生物叫做功能微生物,如氨氧化细菌、硫细菌、硝化细菌等。它们在分类学上有可能差异很大,但却具有相同或类似的基因使其能够发挥同样的作用。支配这些功能细菌发挥重要功能的基因被称为功能基因,如amoAdsrBnxrA。目前凌恩生物已收集GeneBank中所有已知功能基因的序列及其对应的种属信息,构建自己的功能基因数据库。


实验流程

Illunima测序

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PacBio序(扩增子全长测序):

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分析流程

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送样要求


样本要求

样本要求

样品类型1:环境样本(请使用干冰或者冰袋运送)

1土壤5g

2)粪便2g

样品类型2DNA样品(请使用干冰或者冰袋运送)

1DNA总量150ng

2浓度5ng/ul



技术特色


  • 两大测序平台,满足不同多样性检测需求。

  • 多种可选引物,针对不同微生物类型研究方向。

  • 1对1项目服务,直接对接生信分析师,没有中间环节,沟通更高效。

  • 多组学关联分析,可关联代谢组,蛋白组研究结果,全方面深化研究。

  • 多种个性化分析方案,全方位满足研究需要,助力科研成功。



分析示例


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