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背景介绍土壤线虫对农业的影响


 线虫是土壤中数量最大的后生动物,与植物、微生物及其他土壤动物关系密切,对于维持土壤食物网和调节生态系统功能具有十分重要的作用,并且是敏感的土壤健康指示生物。土壤线虫广泛分布于各类土壤中,不同的土壤深度线虫的数量也有所不同,其中10-20cm土层内分布的土壤线虫最多。壤线虫对有机物的分解、养分转化和能量传递起到非常重要的作用,是土壤生态系统的重要组成部分。比如,线虫的排泄物可以贡献土壤中19%的可溶解氮。同时,线虫还被作为土壤指示生物,用来评价生态系统的土壤生物学效应、土壤健康水平、生态系统演替或受干扰的程度。

线虫可引起多种土传病害,对农业危害极大。身长仅有0.3-6mm的它很多肉眼无法观察到,却与50%以上的土壤病害有关,如穿孔线虫、根结线虫、胞囊线虫、茎线虫等。多种多样的线虫让相关领域农科产业减产5%-20%,局部减产达60%甚至绝收。植物线虫对植物的危害一方面源于寄生时口器对植株根茎叶的机械损伤,这些物理攻击造成的外源伤口促进了真菌,细菌和病毒等病原生物对植物体的侵染,使其成为多种植物病害的“易感体”;另一方面,线虫的进食过程中分泌的消化液和多种酶进入到植物的循环系统,扰乱和破坏植物的正常代谢机能,影响其生长发育。多数植物线虫病害没有明显的特异性症状,在田间表现类似缺素症,主要为植物生长衰弱,矮小发黄,产量下降。但是,植物性寄生线虫的活动能力有限,寄生过程中自主迁徙的能力较弱,在没有人为因素的干扰下,其一年间最大影响半径仅1米。遭线虫寄生的植株群落在田间分布为一小块一小块状并枯萎黄化,这是其区别于植物缺素症和土壤缺水缺肥的重要表现,后者的萎蔫黄化则呈整片或整行整列状分布。


项目介绍

土壤线虫学是目前国际上土壤生物学领域最为活跃的方向之一,并被认为是揭示土壤物质循环以及地上/地下生态联系的重要环节。为了减少由线虫引起的农作物破坏和减产等问题的发生,并预测土壤的健康状况和维持土堉生态系统的稳定,对土壤中线虫群落的多样性以及它们对土壤变化过程的影哨研究就显得非常重要。能够准确鉴定出土壤线虫种类和数量可以为采取有效的管理措施和生物安全提供帮助。传统的形态学分离鉴定土壤线虫需要借助显微镜分辨, 而且鉴定人员需要进行专业的培训, 耗时耗力, 例如从单个样品中分离鉴定100—150个土壤线虫需要专业研究人员花费1 h以上。随着高通量测序技术(High-throughput sequencing)日新月异的发展, 我们可直接测序特定基因的PCR产物, 每次分析获得的基因序列数以百万甚至亿万计, 不仅通量高, 而且能够同时分析上百个不同的样品, 是解析复杂环境中微生物群落物种组成和相对丰度的重要工具。

目前, 高通量技术在线虫研究中得到了一定的应用,如国外学者对热带雨林和北极地区的线虫多样性、地中海灌木丛线虫多样性的研究以土壤活线虫作为一种生物指标, 研究分析外来植物在沿海沙丘生态系统中的侵袭作用、热带和温带雨林的线虫空间和生态模式和热带雨林生物多样性,藏北高寒草甸不同土壤深度线虫群落结构特征, 为进一步研究不同植被不同气候变化下土壤线虫群落特点提供有力支持


实验流程

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1 高通量鉴定土壤线虫引物

基因片段引物名称序列产物大小仪器平台
COI

LCO1490

GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG

700bp

PacBio

HCO2198

TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA

18S rRNA V4

NF1-F

GCCTCCCTCGCGCCATCAGGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTT

600bp

18Sr2b

GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTACAAAGGGCAGGGACGTAAT


样本要求

样品类型1:环境样本(请使用干冰或者冰袋运送)

1)土壤≧5g

2)水体样本,0.22µm的滤膜过滤后,送滤膜3-5张,-80℃保存,干冰运输。

样品类型2DNA样品(请使用干冰或者冰袋运送)

1)DNA总量≧150ng;浓度≧5ng/ul




分析示例

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20.png

不同区组土壤线虫群落OTU韦恩图



纲水平上不同区组土壤线虫分布图


25.png

不同样品间的土壤线虫heatmap

Melenchus:剑尾垫刃属、Meloidoderita:无对应中文、Ecphyadophora:突腔唇属、Prismatolaimus:棱咽属、Tylenchus:垫刃属、Clavicaudoides:无对应中文、Tylencholaimus:垫咽属、unclassified_p_Nematoda:未分类的线虫属、Acrobeloides:拟丽突属、Paravulvus:无对应中文、Aphelenchus:滑刃属、Odontolaimus:齿咽属、Hoplolaimus:纽带属、Paratrichodorus:拟毛刺属、Filenchus:丝尾垫刃属、Alaimus:无咽属、Aphelenchoides:类滑刃属、Merlinius:默林属、Dorylaimellus:牙咽属、Meloidogyna:根结线虫属、Pratylenchus:短体属、Longidorus:长针属、Acrobeles:丽突属、Aglenchus:野外垫刃属、Cylindrolaimus:筒咽属、Ditylenchus:茎属、Belonolaimus:刺属、Proleptonchus:原细齿属、Ecumenicus:通俗属、Rhabdolaimus:杆咽属


线虫 (Nematode)引物参考文献:

Porazinska D L, GIBLIN‐DAVIS R M, Faller L, et al. Evaluating high ‐throughput sequencing as a method for metagenomicanalysis of nematode diversity[J]. Molecular ecology resources, 2009, 9(6): 1439-1450.


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