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背景介绍

ABUIABAEGAAg95OVkgYo-aa3zAcw3wQ45gM.png随着现代农业对环境的破坏、食品质量的影响及不可再生能源的大量消耗,环境保护、食品安全、可持续发展已成为当今世界人们普遍关注的主题。维持土壤活力,保护土壤生物多样性已成为生态系统健康关注的重点。我国环境保护部与国土资源部共同发布的《全国土壤污染状况调查公报》显示,全国土壤总点位超标率为16.1%,其中无机污染物超标点位占总超标点位的82%,从污染情况来看,重金属污染尤为严重。土壤是污染物的集散地之一,土壤污染不仅导致土地质量退化,影响农产品安全,而且还可以通过淋溶作用污染地表水、地下水。土壤污染具有隐蔽性、累积性、滞后性等特点,一旦发生严重污染,往往造成不可逆转的严重后果。土壤已成为影响生态环境、耕地质量、食品安全和人类健康的重要因素,是人类赖以生存的基础,土壤环境质量状况与人类息息相关。因此,研究土壤污染物对生物体的毒性作用,由此对环境生态风险早期诊断作出可靠的评估,以期为污染物的早期诊断、早期预防和控制提供基础理论及技术支持,蚯蚓对土壤污染的指示作用及其强化修复的潜力

土壤的污染程度可以通过环境调查和监测进行评价,评估和表征污染物生物效应的一种常见方法是生态风险评价,此方法主要以动物、植物和微生物作试验生物,蚯蚓便是其中的标准化测试物种之一蚯蚓作为土壤污染的指示生物愈来愈受到重视,目前已被广泛应用于土壤污染的监测。有研究表明,蚯蚓组织中的农药和重金属含量可作为监测土壤污染的重要指标。蚯蚓是土壤中普遍存在的无脊椎生物,是土壤系统中重要的组成部分,占土壤动物总量的60%~80%,长期暴露在土壤中,是陆生生物与土壤生物之间的纽带,是农田生态系统中土壤物质生物小循环中重要的一环,被认为是适合对土壤中化学物质进行毒性测试的物种之一。蚯蚓既能够反映土壤的污染状况,又能鉴定指示各种有害物质的毒性。目前,应用于土壤生态毒理试验的蚯蚓有十多种,其中最常用的是生活于腐殖质或富含有机质环境中的赤子爱胜蚓(Eisenia foetida),该蚯蚓由于容易在实验室养殖等优点被广泛应用于新化学品潜在毒性测试及污染土壤的风险评估。

蚯蚓作为土壤生物的重要资源,研究手段却因为技术受到限制。传统的蚯蚓鉴定如形状鉴定、显微鉴定、理化鉴定等需要较高经验和专业水平的人士,加之动物类鉴定和分类学的专业人员较少,无法满足市场需求。因此,利用现代科学技术,寻找一种适用于土壤蚯蚓品种鉴定的快捷、准确的方法成为当务之急。


项目介绍

近年来,随着分子生物技术的进步和日益成熟,分子生物学鉴定方法也随之诞生,应用DNA分子标记技术鉴定蚯蚓分类取得了快速发展。高通量测序检测土壤蚯蚓操作简单,同时具有成本低、重现性好、相比于传统蚯蚓鉴定方法更加精确高效等优点,使得鉴定结果准确、可靠、高重现性成为可能。此外,采用国际通用的动物DNA条形码基因对蚯蚓物种的序列进行比较研究,探讨其分类系统中的地位并为蚯蚓物种的分类系统提供一些必要的分子生物学数据,并通过比对序列,寻找差异位点,最后获得检测土壤中全面的物种鉴别及系统发遇信息。


实验流程

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1 高通量鉴定土壤蚯蚓引物

基因片段引物名称序列产物大小仪器平台
COI

LCO1490

GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG

700bp

PacBio

HCO2198

TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA

12S rRNA

12Sr

TGTGTGCATGTCTCAGATTCG

350bp

Illumina

12Sf

CAAGATTTTGGCGGTGTCTCA

16S rRNA

16Sr

GGTATCCTAACCGTGCAAAGG

320bp

16Sf

CAACCCCCACTATTGATAAGGACT


       常见土壤蚯蚓品种:

用于土壤生态检测的蚯蚓主要来自后孔寡毛目的正蚯蚓科(Lumbricidae),巨蚓科(Megascolecidae)和真蚓科(Eudrilidae)。


2 高通量鉴定土壤蚯蚓种类









Eisenia fetida 赤子爱胜

Eisenia andrei 安德爱胜蚓

Eisenia venrta 维尼斯爱胜蚓

Lumbricus rubellus 红正蚓

Lumbricus terrestris 陆正蚓
Aporrectodea longa 长流蚓

Dendrobaena rubidus 红丛林蚓

Aporrectodea caliginosa 背暗流蚓
Allolobophora caliginosa 背暗异唇蚓
Octolasium cyaneum
Eudrilus eugenicae

Perionyx excavatus

Pheretima posthuma
Octochartus pattoni
Allolobophora tuberculata
Allolobophora chlorotica


样本要求

样品类型1:环境样本(请使用干冰或者冰袋运送)

1土壤≧5g

2水体样本,0.22µm的滤膜过滤后,送滤膜3-5张,-80℃保存,干冰运输。

样品类型2DNA样品(请使用干冰或者冰袋运送)

1DNA总量≧150ng浓度≧5ng/ul



分析示例

19.png   

20.png

OTU venn图(花瓣图)


组分图

25.png

3D-PCA分析

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