土壤微生物群落结构和多样性及其变化在一定程度上反映了土壤的质量。土壤微生物多样性一般包括微生物分类群的多样性、遗传(基因) 多样性、生态特征多样性和功能多样性。由于土壤微生物的复杂性、土壤本身的多变性和研究方法不完善等原因的限制, 以往人们对土壤微生物多样性的研究与动、植物相比远远落后。

随着测序技术的发展，高通量测序已成为定量和鉴别微生物群落演替的更好的研究工具。该技术能够在整体微生物细菌群落水平下分析物种遗传多样性，并能较为客观的反映样本中低丰度的重要功能微生物。该技术具有测序通量高、试验过程简化、速度快、准确率高等优点，试验结果能够更好地反应出群落结构的特点，高通量测序技术的发展则为研究土壤宏基因组提供了大量数据，为直接探究土壤中的微生物群落结构提供了客观而全面的信息。

微生物多样性测序，又名扩增子测序，是对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行测序，主要包括16S rDNA测序、18S rDNA测序、ITS测序及目标区域扩增子测序等。采用第二代高通量测序平台测定的16S/18S/ITS某个高变区域的序列，来反映环境样品在细菌、真菌、古菌分类方面物种之间的差异，对研究海洋、土壤、肠道粪便等环境中的微生物构成有重要的指导作用。

凌恩生物根据不同的研究目的和需求，扩增子测序可以细分为如下4个产品：

16S rDNA测序：16S rDNA为编码原核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，主要进行细菌或古菌的多样性分析。细菌核糖体RNA（rRNA）有三种类型：5S rRNA（120bp）、16S rRNA（约1540bp）和23S rRNA（约2900bp）。5S rRNA基因序列较短，包含的遗传信息较少，不适于细菌种类的分析鉴定；23S rRNA基因的序列太长，且其碱基的突变率较高，不适于鉴定亲缘关系较远的细菌种类；16S rRNA普遍存在于原核细胞中，且含量较高、拷贝数较多（占细菌RNA总量的80%以上），便于获取模板，功能同源性高，遗传信息量适中，适于作为细菌多样性分析的标准。16S rRNA编码基因序列共有10个保守区和9个高可变区。

18S rDNA测序：18S rDNA为编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，反映样品中真核生物之间的种类差异。与细菌多样性分析类似，在真核微生物中也有三类核糖体RNA（rRNA），包括5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA。18S rRNA基因是编码真核生物核糖体小亚基的DNA序列，其中既有保守区，也有可变区（V1-V9，没有V6区）。保守区域反映了生物物种间的亲缘关系，而可变区则能体现物种间的差异，适用于作种级及以上的分类标准。

ITS测序：该类测序主要对环境微生物中的真菌多样性进行分析。包含两个区域：ITS1位于真核生物核糖体rDNA序列18S和5.8S之间；ITS2位于真核生物核糖体rDNA序列5.8S和28S之间。ITS序列是内源转录间隔区（Internally Transcribed Spacer），位于真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之间，分别为ITS 1和ITS 2。在真菌中，5.8S、18S和28S rRNA基因具有较高的保守性，而ITS由于承受较小的自然选择压力，在进化过程中能够容忍更多的变异，在绝大多数真核生物中表现出极为广泛的序列多态性。同时，ITS的保守型表现为种内相对一致，种间差异较明显，能够反映出种属间，甚至菌株间的差异。并且ITS序列片段较小（ITS 1和ITS 2长度分别为350 bp和400 bp），易于分析，目前已被广泛用于真菌不同种属的系统发育分析。

功能基因扩增子测序：根据客户的研究需求，基于功能基因/持家基因/靶基因等，对特定基因的PCR产物进行测序。在自然界的各类环境中，都有微生物的存在，它们在各自的“岗位”上都发挥着或大或小、或多或少的作用。有一些具有特殊功能的微生物，由于其作用的重要性或特殊性而受到人们的广泛关注，这些具有特殊功能的微生物叫做功能微生物，如氨氧化细菌、硫细菌、硝化细菌等。它们在分类学上有可能差异很大，但却具有相同或类似的基因使其能够发挥同样的作用。支配这些功能细菌发挥重要功能的基因被称为功能基因，如amoA、dsrB、nxrA。目前凌恩生物已收集GeneBank中所有已知功能基因的序列及其对应的种属信息，构建自己的功能基因数据库。

Illunima测序：

PacBio测序（扩增子全长测序）：

古细菌（archaebacteria）又叫古生菌、古菌，是一类很特殊的细菌，同时具有原核生物和真核生物的某些特征。古菌可能是最古老的生命体，古菌一些奇特的生活习性和与此相关的潜在生物技术开发前景，长期以来一直吸引着许多人的注意。古菌常被发现生活于各种极端自然环境下，如大洋底部的高压热溢口、热泉、盐碱湖等。古菌的研究具有重要意义，它们生存在极端特殊的生态环境中，具有独特的16S核糖体RNA寡核苷酸谱。能适应严寒、酷暑等极端环境，同时驱动着土壤碳、氮、硫等营养元素的生物地球化学循环。

古菌在土壤微生物群落及生物量亦占有不可忽视的比例。从古菌群落组成来看，古菌序列主要来自奇古菌门，其次来自广古菌门，二者参与了土壤碳、氮和氢的生物地球化学循环。已知奇古菌具有氨氧化、反硝化等多样的生理代谢特性和功能，易繁衍在有机质含量低、含水量较低，即氨态氮含量低的土壤。已有研究表明，广古菌的相对丰度随氨态氮的增加会显著增加，而且还与土壤中的可利用硫正相关，土壤分子微生态学研究古菌，一方面可以了解古菌在土壤早期形成所起的生化作用，更重要的是可以提高分子微生态学的水平。

微生物多样性测序，又名扩增子测序，是对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行测序，主要包括16S rDNA测序、18S rDNA测序、ITS测序及目标区域扩增子测序等。采用第二代高通量测序平台测定的16S/18S/ITS某个高变区域的序列，来反映环境样品在细菌、真菌、古菌分类方面物种之间的差异，对研究海洋、土壤、肠道粪便等环境中的微生物构成有重要的指导作用。

凌恩生物根据不同的研究目的和需求，扩增子测序可以细分为如下4个产品：

16S rDNA测序：16S rDNA为编码原核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，主要进行细菌或古菌的多样性分析。细菌核糖体RNA（rRNA）有三种类型：5S rRNA（120bp）、16S rRNA（约1540bp）和23S rRNA（约2900bp）。5S rRNA基因序列较短，包含的遗传信息较少，不适于细菌种类的分析鉴定；23S rRNA基因的序列太长，且其碱基的突变率较高，不适于鉴定亲缘关系较远的细菌种类；16S rRNA普遍存在于原核细胞中，且含量较高、拷贝数较多（占细菌RNA总量的80%以上），便于获取模板，功能同源性高，遗传信息量适中，适于作为细菌多样性分析的标准。16S rRNA编码基因序列共有10个保守区和9个高可变区。

18S rDNA测序：18S rDNA为编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，反映样品中真核生物之间的种类差异。与细菌多样性分析类似，在真核微生物中也有三类核糖体RNA（rRNA），包括5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA。18S rRNA基因是编码真核生物核糖体小亚基的DNA序列，其中既有保守区，也有可变区（V1-V9，没有V6区）。保守区域反映了生物物种间的亲缘关系，而可变区则能体现物种间的差异，适用于作种级及以上的分类标准。

ITS测序：该类测序主要对环境微生物中的真菌多样性进行分析。包含两个区域：ITS1位于真核生物核糖体rDNA序列18S和5.8S之间；ITS2位于真核生物核糖体rDNA序列5.8S和28S之间。ITS序列是内源转录间隔区（Internally Transcribed Spacer），位于真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之间，分别为ITS 1和ITS 2。在真菌中，5.8S、18S和28S rRNA基因具有较高的保守性，而ITS由于承受较小的自然选择压力，在进化过程中能够容忍更多的变异，在绝大多数真核生物中表现出极为广泛的序列多态性。同时，ITS的保守型表现为种内相对一致，种间差异较明显，能够反映出种属间，甚至菌株间的差异。并且ITS序列片段较小（ITS 1和ITS 2长度分别为350 bp和400 bp），易于分析，目前已被广泛用于真菌不同种属的系统发育分析。

功能基因扩增子测序：根据客户的研究需求，基于功能基因/持家基因/靶基因等，对特定基因的PCR产物进行测序。在自然界的各类环境中，都有微生物的存在，它们在各自的“岗位”上都发挥着或大或小、或多或少的作用。有一些具有特殊功能的微生物，由于其作用的重要性或特殊性而受到人们的广泛关注，这些具有特殊功能的微生物叫做功能微生物，如氨氧化细菌、硫细菌、硝化细菌等。它们在分类学上有可能差异很大，但却具有相同或类似的基因使其能够发挥同样的作用。支配这些功能细菌发挥重要功能的基因被称为功能基因，如amoA、dsrB、nxrA。目前凌恩生物已收集GeneBank中所有已知功能基因的序列及其对应的种属信息，构建自己的功能基因数据库。

Illunima测序：

PacBio测序（扩增子全长测序）：

土壤线虫对农业的影响：

线虫是土壤中数量最大的后生动物，与植物、微生物及其他土壤动物关系密切，对于维持土壤食物网和调节生态系统功能具有十分重要的作用，并且是敏感的土壤健康指示生物。土壤线虫广泛分布于各类土壤中，不同的土壤深度线虫的数量也有所不同，其中10-20cm土层内分布的土壤线虫最多。土壤线虫对有机物的分解、养分转化和能量传递起到非常重要的作用，是土壤生态系统的重要组成部分。比如，线虫的排泄物可以贡献土壤中19%的可溶解氮。同时，线虫还被作为土壤指示生物，用来评价生态系统的土壤生物学效应、土壤健康水平、生态系统演替或受干扰的程度。

线虫可引起多种土传病害，对农业危害极大。身长仅有0.3-6mm的它很多肉眼无法观察到，却与50%以上的土壤病害有关，如穿孔线虫、根结线虫、胞囊线虫、茎线虫等。多种多样的线虫让相关领域农科产业减产5%-20%，局部减产达60%甚至绝收。植物线虫对植物的危害一方面源于寄生时口器对植株根茎叶的机械损伤，这些物理攻击造成的外源伤口促进了真菌，细菌和病毒等病原生物对植物体的侵染，使其成为多种植物病害的“易感体”；另一方面，线虫的进食过程中分泌的消化液和多种酶进入到植物的循环系统，扰乱和破坏植物的正常代谢机能，影响其生长发育。多数植物线虫病害没有明显的特异性症状，在田间表现类似缺素症，主要为植物生长衰弱，矮小发黄，产量下降。但是，植物性寄生线虫的活动能力有限，寄生过程中自主迁徙的能力较弱，在没有人为因素的干扰下，其一年间最大影响半径仅1米。遭线虫寄生的植株群落在田间分布为一小块一小块状并枯萎黄化，这是其区别于植物缺素症和土壤缺水缺肥的重要表现，后者的萎蔫黄化则呈整片或整行整列状分布。

土壤线虫学是目前国际上土壤生物学领域最为活跃的方向之一，并被认为是揭示土壤物质循环以及地上/地下生态联系的重要环节。为了减少由线虫引起的农作物破坏和减产等问题的发生，并预测土壤的健康状况和维持土堉生态系统的稳定，对土壤中线虫群落的多样性以及它们对土壤变化过程的影哨研究就显得非常重要。能够准确鉴定出土壤线虫种类和数量可以为采取有效的管理措施和生物安全提供帮助。传统的形态学分离鉴定土壤线虫需要借助显微镜分辨, 而且鉴定人员需要进行专业的培训, 耗时耗力, 例如从单个样品中分离鉴定100—150个土壤线虫需要专业研究人员花费1h以上。随着高通量测序技术(High-throughput sequencing)日新月异的发展, 我们可直接测序特定基因的PCR产物, 每次分析获得的基因序列数以百万甚至亿万计, 不仅通量高, 而且能够同时分析上百个不同的样品, 是解析复杂环境中微生物群落物种组成和相对丰度的重要工具。

目前, 高通量技术在线虫研究中得到了一定的应用，如国外学者对热带雨林和北极地区的线虫多样性、地中海灌木丛线虫多样性的研究以土壤活线虫作为一种生物指标, 研究分析外来植物在沿海沙丘生态系统中的侵袭作用、热带和温带雨林的线虫空间和生态模式和热带雨林生物多样性，藏北高寒草甸不同土壤深度线虫群落结构特征, 为进一步研究不同植被不同气候变化下土壤线虫群落特点提供有力支持。

表1 高通量鉴定土壤线虫引物

土壤真菌具有重要的生态功能，是生态系统中的重要组成部分，既包含有益真菌，也包含病原真菌，它们共同构成了土壤真菌的多样性。土壤真菌的多样性及其群落结构组成是评价其所在生态系统健康稳定的重要指标之一。近年来不仅对土壤真菌多样性和群落结构特征方面进行研究，而且对其生物功能，如土壤 真菌在生物防治、有害物质吸附和降解等方面也进行了研究和探索。

土壤微生物蕴藏着丰富的生物资源，土壤真菌是土壤微生物的主要成员，并与其他微生物一起推动着陆地生态系统的能源流动和物质循环，维持着生态系统正常运转，是生态系统中最重要的组成部分。土壤真菌多样性及其群落结构组成都对生态系统产生深远的影响，对农作物生产，生态系统的平衡起着重要的作用，根际土壤真菌作为根际生态系统中的重要组成，是分解者中的先锋物种，在维持根际生态系统稳定、代谢调节和抗病虫害等方面有重要调节作用。土壤真菌数量巨大，种类繁多。传统的培养法遗漏了土壤中绝大多数真菌，难以反映真菌群落多样性全貌。分子指纹图谱如变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)和末端限制性片段长度多态性(terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)方法虽然具有高通量的优势，能够指示不同群落结构的差别，但对微生物的认识也是有限的。克隆测序的方法虽然能给出微生物群落的更多信息，但与土壤真菌巨大的多样性相比，克隆文库显得太小，提供的信息仍然偏少。高通量测序技术拥有数据产出通量高、获得信息丰富、快捷和读长长等优点，使人们有能力研究高度复杂的真菌群落和稀有的微生物类群，因此高通量测序技术越来越多地被应用于土壤微生物生态学研究中。

微生物多样性测序，又名扩增子测序，是对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行测序，主要包括16S rDNA测序、18S rDNA测序、ITS测序及目标区域扩增子测序等。采用第二代高通量测序平台测定的16S/18S/ITS某个高变区域的序列，来反映环境样品在细菌、真菌、古菌分类方面物种之间的差异，对研究海洋、土壤、肠道粪便等环境中的微生物构成有重要的指导作用。

凌恩生物根据不同的研究目的和需求，扩增子测序可以细分为如下4个产品：

16S rDNA测序：16S rDNA为编码原核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，主要进行细菌或古菌的多样性分析。细菌核糖体RNA（rRNA）有三种类型：5S rRNA（120bp）、16S rRNA（约1540bp）和23S rRNA（约2900bp）。5S rRNA基因序列较短，包含的遗传信息较少，不适于细菌种类的分析鉴定；23S rRNA基因的序列太长，且其碱基的突变率较高，不适于鉴定亲缘关系较远的细菌种类；16S rRNA普遍存在于原核细胞中，且含量较高、拷贝数较多（占细菌RNA总量的80%以上），便于获取模板，功能同源性高，遗传信息量适中，适于作为细菌多样性分析的标准。16S rRNA编码基因序列共有10个保守区和9个高可变区。

18S rDNA测序：18S rDNA为编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，反映样品中真核生物之间的种类差异。与细菌多样性分析类似，在真核微生物中也有三类核糖体RNA（rRNA），包括5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA。18S rRNA基因是编码真核生物核糖体小亚基的DNA序列，其中既有保守区，也有可变区（V1-V9，没有V6区）。保守区域反映了生物物种间的亲缘关系，而可变区则能体现物种间的差异，适用于作种级及以上的分类标准。

ITS测序：该类测序主要对环境微生物中的真菌多样性进行分析。包含两个区域：ITS1位于真核生物核糖体rDNA序列18S和5.8S之间；ITS2位于真核生物核糖体rDNA序列5.8S和28S之间。ITS序列是内源转录间隔区（Internally Transcribed Spacer），位于真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之间，分别为ITS 1和ITS 2。在真菌中，5.8S、18S和28S rRNA基因具有较高的保守性，而ITS由于承受较小的自然选择压力，在进化过程中能够容忍更多的变异，在绝大多数真核生物中表现出极为广泛的序列多态性。同时，ITS的保守型表现为种内相对一致，种间差异较明显，能够反映出种属间，甚至菌株间的差异。并且ITS序列片段较小（ITS 1和ITS 2长度分别为350 bp和400 bp），易于分析，目前已被广泛用于真菌不同种属的系统发育分析。

功能基因扩增子测序：根据客户的研究需求，基于功能基因/持家基因/靶基因等，对特定基因的PCR产物进行测序。在自然界的各类环境中，都有微生物的存在，它们在各自的“岗位”上都发挥着或大或小、或多或少的作用。有一些具有特殊功能的微生物，由于其作用的重要性或特殊性而受到人们的广泛关注，这些具有特殊功能的微生物叫做功能微生物，如氨氧化细菌、硫细菌、硝化细菌等。它们在分类学上有可能差异很大，但却具有相同或类似的基因使其能够发挥同样的作用。支配这些功能细菌发挥重要功能的基因被称为功能基因，如amoA、dsrB、nxrA。目前凌恩生物已收集GeneBank中所有已知功能基因的序列及其对应的种属信息，构建自己的功能基因数据库。

Illunima测序：

PacBio测序（扩增子全长测序）：

送样要求

土壤是陆生动植物生活的基底，它不仅为植物提供必需的营养和水分，还是土壤动物赖以生存的栖息场所。对植物来说，植物根系与土壤有着极大的接触面，可以在植物和土壤之间进行频繁的物质交换，因此通过控制土壤因素就可影响植物的生长和产量。对动物来说，土壤是比大气环境更为稳定的生活环境。其温度和湿度的变化幅度要小得多，因此土壤常常成为动物的极好隐蔽场所，在土壤中可以躲避高温、干燥、大风和阳光直射。

生态系统中的很多重要过程都是在土壤中进行的，土壤元素循环是指以土壤为核心，土壤中的元素与生物圈（农田中主要为作物）、水圈、大气圈和岩石圈的交换途径、形态和通量。由于不同存在形态或价态的元素在土壤中的移动性、与其他圈层的交换性及其生物和环境效应不同，且它们在土壤中的量由土壤转化过程及其相对速率所决定，所以，土壤养分转化过程起着土壤元素循环“调配器”的作用，控制土壤元素循环的方向、元素化合物种类和交换通量。

元素循环是生物地球化学循环的重要环节，主要涉及碳、氮、磷、硫等元素的循环过程。环境中的各种微生物会广泛参与到元素循环的过程中，其数量、质量及代谢速率与所在生态系统乃至整个生物圈的结构、功能、动态过程和生产密切相关。自然界中广泛分布的微生物是自然界碳、氮、磷、硫元素循环的主要驱动力，通过检测微生物基因组中涉及碳、氮、磷、硫代谢循环相关的功能基因，可综合分析不同生境下碳、氮、磷、硫循环的整体水平并评价微生物对此过程的影响，为土壤健康和影响评价提供基因水平上的有力证据。

凌恩生物建立了完整的碳、氮、磷、硫循环循环模式图，对宏基因组数据进行深入挖掘，通过循环模式图，确定不同代谢过程所涉及的功能基因及其丰度计算方法，对环境样品微生物群落碳、氮、磷、硫循环能力进行分析及比较，进一步通过对识别到的相关功能基因所属物种进行分类学注释，识别环境样本中参与碳、氮、磷、硫循环的主要功能微生物种属。

土壤氮素循环

土壤氮素循环是生物地球化学循环的重要组成部分,不但影响着土壤生产力和可持续发展,还影响着全球环境变化。土壤微生物在土壤氮循环中发挥着不可替代的作用,参与了包括固氮作用、氨化作用、硝化作用和反硝化作用等重要生态过程。特别是分解和固氮过程。生物遗体只有通过分解过程才能转化为腐殖质，成为可被植物再利用的营养物质；而固氮过程则是土壤氮肥的主要来源。这两个过程都是整个生物圈物质循环所不可缺少的环节。近十年中,分子生物学技术的发展为从功能基因角度研究与土壤氮循环密切相关的微生物功能群结构、组成和丰度的变化提供了新的契机。

土壤碳素循环路径

Illunima测序：

送样要求